2024年4月11日，首都医科大学宣武医院神经外科陈赞教授团队在《British Journal of Cancer》（JCR分区Q1，IF：8.8）期刊上发表了题“Single-cell sequencing reveals VEGFR as a potential target for CAR-T cell therapy in chordoma ”的研究论文。宣武医院神经外科吴焕童博士、张博彦博士为共同第一作者，陈赞教授、段婉茹教授为通讯作者。

脊索瘤是一种罕见的原发性骨肿瘤，起源于脊索残余组织。脊索瘤每年的发病率约为十万分之0.08，男性居多，发病高峰期在五十岁左右。目前脊索瘤尚无有效的治疗方法，完全手术切除是现在的主要治疗手段。因为手术复杂（如邻近神经或血管）导致切除不完全的患者会在术后进行放疗。脊索瘤患者的中位总生存期（OS）约为6到7年，但临床病程各不相同。脊索瘤一般表现为为中低分化、局部侵袭性恶性肿瘤，但其表现可能多种多样，导致有些患者病情进展迅速。因此，约有三分之一的脊索瘤患者会出现局部扩散和转移，在复发、难治或转移的情况下，脊索瘤被治愈可能性较低。

因此，亟需有效的疗法来减少复发和病情进展，并在复发时进行治疗。

陈赞教授团队通过收集临床患者的肿瘤样本组织进行单细胞测序，通过分析脊索瘤患者的肿瘤异质性和基因表达情况来寻找脊索瘤治疗的潜在靶点。2022年，陈赞教授团队发表首篇脊索瘤患者的单细胞测序文章“Single‐cell transcriptome profiling reveals intra‐tumoral heterogeneity in human chordomas ”发表在《Cancer Immunol Immunotherapy》（JCR分区Q1，IF：5.8）。

近日，研究团队在前期研究的基础上，扩大脊索瘤测序样本量，对脊索瘤的靶点、信号通路的相关表达进行检测。发现可用于脊索瘤免疫治疗的靶点VEGFR，构建VEGFR CAR-T细胞。同时发现在脊索瘤细胞的样本组织中TGF-β信号通路是脊索瘤肿瘤微环境中高表达的细胞间信号通路。因此在VEGFR CAR结构上增加一个TGF-β scFv结构，能够结合肿瘤微环境中的TGF-β，改善TGF-β对脊索瘤细胞的影响。

对14例脊索瘤患者的肿瘤组织样本进行单细胞测序。检测发现脊索瘤肿瘤样本中异质性高，肿瘤组织中细胞成分复杂。在肿瘤细胞方面，原发肿瘤样本和复发肿瘤样本存在差异。在肿瘤微环境中，发现免疫细胞（主要是T细胞和B细胞）中TGF-β的表达增加，以及内皮细胞和肿瘤细胞中VEGFR2的表达增加，这在原发样本和复发样本中都是一致的。脊索瘤肿瘤样本的免疫组化进一步证实了这些表达模式（图1）。

接下来，我们进行了细胞间通讯分析，以确定脊索瘤肿瘤微环境内潜在的相互作用途径。Cellchat分析结果，发现了TME内的TGF-β信号传导是高表达的。这一通路的主要特点是T细胞和B细胞以及内皮细胞是TGF-β信号的主要发送者，而髓系细胞和成纤维细胞则是接收者。在这一途径中，最显著的配体-受体相互作用是TGFβ1-TGFβR1/TGFβR2（图2）。

图1. 人类脊索瘤的单细胞异质性图谱

图2. 脊索瘤肿瘤微环境的细胞通讯网络分析

通过测序确定了脊索瘤中TGFβ和VEGFR高表达后，课题组制备了两种靶向血管内皮生长因子受体的CAR：VEGFR CAR和与TGF-β scFv 结合的VEGFR/TGF-β scFv CAR。接下来，用具有恶性增殖潜能的JHC-7脊索瘤细胞系评估了CAR-T细胞对表达VEGFR的脊索瘤细胞的激活和杀伤作用。对照组、VEGFR和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T 细胞与JHC-7细胞以不同的效应物-靶标比孵育。VEGFR CAR-T细胞和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞对JHC-7细胞都表现出细胞毒性，这种毒性与E/T比呈正相关。

为了评估CAR-T细胞变体对肿瘤细胞的持续影响，在第0、2、4和6天将 JHC-7 肿瘤细胞引入培养系统。在不同的时间间隔内，观察的VEGFR和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞对肿瘤细胞的持续杀伤作用。

TGF-β在实体瘤的免疫抑制中起着至关重要的作用。因此，我们将VEGFR CAR-T细胞和VEGFR/TGF-βCAR-T细胞与JHC-7细胞以4:1的E:T比例共培养20小时，并在培养体系中加入外源的TGF-β因子。与VEGFRCAR-T实验组相比，VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞表现出更强的细胞毒性。与TGF-β共培养时，两种CAR-T细胞的细胞毒性都有所下降。然而，VEGFR/TGF-β scFv CAR-T的减少了培养体系内的TGF-β，从而提高了杀伤效果。VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞显示出更好的持续杀伤能力（图3）。

图3.VEGFR CAR 和VEGFR/TGF-β CAR-T细胞的制备和组成

为了评估CAR-T细胞在临床环境中的有效性，我们在表达VEGFR的患者源性脊索瘤类器官模型中对其杀伤效果进行了测试。对照组、VEGFR和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞以不同的E/T比孵育。VEGFR CAR-T细胞和VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞对类器官表现出明显的细胞毒性，细胞毒性与E/T比值呈正相关。VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞的细胞毒性优于VEGFR CAR-T细胞。

为了评估CAR-T细胞对原代脊索瘤细胞的持续细胞毒性，课题组将CAR-T细胞与原代脊索瘤细胞共培养，每隔一天时间重复加入原代肿瘤细胞，以评估CAR-T细胞的持续细胞毒性。研究发现VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞对脊索瘤类器官表现出更持久的持续细胞毒性。同时检测共培养体系中细胞上清中TGF-β的浓度，VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞在培养系统中表现出对TGF-β的亲和力增强，从而保留了CAR-T细胞的细胞毒性（图4）。

图4.VEGFR/TGF-β在患者源性脊索瘤类器官模型中杀伤效果

课题组分析了14例脊索瘤患者的单细胞测序数据，从而为脊索瘤生物学以及脊索瘤中恶性细胞、间质细胞和免疫细胞图谱提供了重要结果。测序结果显示，VEGFR是CAR-T治疗脊索瘤的一个潜在靶点，并且TGF-β可以联合用于脊索瘤免疫治疗。实验表明，VEGFR/TGF-β scFv CAR-T细胞对脊索瘤细胞(包括原发性脊索瘤类器官)表现出较强的细胞毒性和对肿瘤细胞的持续杀伤能力。虽然CAR-T细胞在脊索瘤患者异种移植模型或其他有效的体内模型中需要进一步的临床前验证，但这项研究为脊索瘤患者提供了新的治疗选择。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41416-024-02635-5

通讯作者

陈赞，神经外科主任医师，教授，博士研究生导师。

毕业于哈尔滨医科大学，在闫景龙教授指导下获得医学硕士、在杨立庄教授指导下获得神经外科博士学位，并在宣武医院凌锋教授指导下进一步攻读博士后，研究方向：显微脊柱外科。学术职务：中华医学会神经外科分会脊柱神经外科学组副组长、中华医师协会神经外科分会委员会脊柱神经外科学组专家委员、中国医疗保健国际交流促进会骨科疾病防治专业委员会脊柱内镜组副主委、北京康复医学会脊柱脊髓损伤第五届专业委员会副主委、AO国际脊柱外科学会讲师、世界神经外科联合会(WFNS)脊柱学组委员、国际颅颈交界区畸形和脊柱学会执行委员。

擅长应用显微神经外科技术等微侵袭方式治疗颈椎病、腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄、椎管内肿瘤、Chiari畸形、脊髓空洞症、寰枢椎脱位方面具有丰富临床经验。

每年手术例数超过1000例，累计手术量超万例。主持科研课题10余项，参编著作多部，发表SCI论文10篇，核心期刊论文30篇，获得国家专利2项。

【出诊时间】周三上午、周三下午

通讯作者

段婉茹，宣武医院神经外科副主任医师，副教授，硕士生导师。

从事脊柱脊髓微创手术治疗；主持中国国际神经科学研究所脊髓损伤与功能重建实验室工作，任中国医学科学院脊柱畸形大数据研究应用重点实验室PI；并长期负责神经脊柱中心的教学和培训。以第一作者和通讯作者发表中英文论文三十余篇。主持科技部重点研发（青年科学家项目）、国自然，北自然-海淀、科委首特项目等项目及课题。入选北京医管局青苗人才。

兼任中国女医师协会神经外科专委会常委兼秘书长，中国残疾人康复协会第一届人工智能康复专业委员会副主任委员，中国解剖学会人脑库研究分会委员；北京卫生法学大数据与互联网人工智能医疗专业委员会委员，《中华创伤杂志》青年学术委员会委员；AO Spine青年讲师，Human Brain杂志编委；中国志愿医生组织成员，太阳语罕见病心理关怀中心医疗康复顾问，房山区青联第五届委员会常委。 

获第二届中国健康长寿创新大赛三等奖、第五届中国医疗器械创新创业大赛医院专场赛二等奖、北京医学会神经外科学术年会青年医师手术展示优秀奖；中国初级卫生保健基金会-大病不出县行走的医院医者工匠奖、第六届国之名医青年新锐。

【出诊时间】周二上午

第一作者

吴焕童，博士毕业于首都医科大学，现为首都医科大学宣武医院神经外科博士后。从事脊索瘤免疫治疗的基础研究。主要研究方向为CAR-T细胞治疗恶性肿瘤，参与过CAR-T细胞治疗B细胞急性淋巴瘤临床试验，发表SCI论文4篇。

共同第一作者

张博彦，首都医科大学宣武医院在读博士研究生，师从陈赞教授。主要研究方向为脊柱脊髓疾病。以第一或共同第一作者发表SCI文章2篇。